菌種保存和微生物常識

　　1、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒

　　營養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動所必需的能量和物質(zhì)，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活動的物質(zhì)基礎，是生命活動的起點。

　　營養(yǎng)物：具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能。提供生物的結(jié)構物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。

　　營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水

　　培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求：應具備6大營養(yǎng)要素;物質(zhì)比例合適;必須滅菌。

　　2、選用和設計培養(yǎng)基的原則、方法及制備過程

　　原則：目的明確 、營養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟節(jié)約

　　物理化學條件適宜

　　方法：生態(tài)模擬、查閱文獻

　　精心設計、試驗比較

　　步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過濾、分裝、

　　加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查

　　培養(yǎng)基種類：

　　一、按成分的不同分

　　天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基

　　二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分

　　固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基

　　三、按培養(yǎng)基用途

　　基礎培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 、加富培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基

　　消毒與滅菌 ：

　　消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體

　　滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。

　　方法：

　　一、物理的方法：加熱、過濾、輻射

　　二、化學的方法：用化學試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。

　　加熱法：

　　(1)干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。

　　1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。

　　2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣(160-170C)加熱滅菌1-2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關，當環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。

　　3、注意事項：

　　1)培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法;

　　2)溫度控制在<180°;

　　3)物品不能太擠;

　　4)溫度降至70°時才開箱門。

　　(2)濕熱法 ：原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低;濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。

　　高壓蒸汽滅菌法：

　　1、設備：高壓滅菌鍋

　　2、時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。

　　3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。

　　4、注意事項：

　　1)冷空氣徹底排除;2)加水;3)壓力降為“0”時方可打開。

　　常壓蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

　　煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10-15min，

　　超高溫殺菌:135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品。優(yōu)點 ：保持食品價值和營養(yǎng)成分。

　　過濾除菌：

　　原理：介質(zhì)在有壓力時阻隔微生物。

　　適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。

　　設備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。

　　優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。需 大量無菌空氣以及凈化工作臺。

　　注意事項：1、壓力適當;

　　2、無菌條件下進行;

　　3、防止?jié)B透現(xiàn)象。

　　輻射滅菌：

　　原理：紫外線波長在200-300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細胞中核酸吸收;可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。

　　缺點：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。

　　應用：無菌室，醫(yī)院。

　　注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。

　　射線滅菌：r射線，穿透力強，適用于堆積物品的滅菌。

　　化學藥品滅菌：

　　原理：應用化學制劑破壞細菌代謝機能。

　　殺菌劑如重金屬離子;

　　抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。

　　注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關。

　　常用化學殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸

　　福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等

　　3、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術

　　分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。

　　為什么要進行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。

　　常用的分離、純化方法：

　　單細胞挑取法 稀釋涂布平板法

　　稀釋混合平板法 平板劃線法

　　稀釋涂布平板法 ：

　　步驟：

　　1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。

　　2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。

　　3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。

　　4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days。

　　5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。

　　平板劃線法：

　　1、倒平板，標記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。

　　2、劃線方法

　　稀釋混合平板法 ：

　　1、先加菌

　　2、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度

　　3、混合均勻

　　4、微生物培養(yǎng)技術

　　1、斜面接種

　　2、液體培養(yǎng)基接種

　　3、穿刺接種

　　4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng) 基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

　　5、將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

　　幾種常用的保藏方法：

　　1、傳代培養(yǎng)法

　　保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基(用于厭氧細菌)培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進行傳代培養(yǎng)、再存放。

　　可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。

　　2、載體法

　　使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。

　　常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。

　　3、懸液法

　　將細菌、酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存。

　　溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。

　　4、冷凍法

　　使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。

　　此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。

　　5、真空干燥法

　　這類方法包括冷凍真空干燥法和L-干燥法。

　　冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預凍，然后在低溫狀態(tài)下進行減壓干燥。

　　L-干燥法則不需要低溫預凍樣品，只是使樣品維持在10-20C?范圍內(nèi)進行真空干燥。

　　操作方法

　　1、斜面保藏法

　　將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好(棉塞換成膠塞效果更好)，置4C?冰箱中包藏。

　　保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2-4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。

　　此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。

　　2、液體石蠟保藏法

　　將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準，使菌種與空氣隔絕。

　　將試管直立，置低溫或室溫下保存。

　　此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1-2年，普通細菌也可保藏1年左右。

　　3、穿刺保藏法

　　按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴，置4℃冰箱存放。

　　4、砂土管保藏法

　　(1)河砂處理

　　取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。

　　(2)土壤處理

　　取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

　　(3)砂土混合

　　處理妥當?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。

　　(4)無菌檢查

　　每10支砂土管隨機抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用。

　　(5)菌懸液的制備

　　取生長健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。

　　(6)分裝樣品

　　每支砂土管(注明標記后)加入0.5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)， 用接種針拌勻。

　　(7)干燥

　　將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。

　　(8)保存

　　置4℃冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多用于產(chǎn)芽孢的細菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛、效果較好，可保存幾年時間，但對營養(yǎng)細胞效果不佳。

　　5、冷凍真空干燥法

　　(1)凍干管的準備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。

　　(2)菌種培養(yǎng)：細菌芽孢脫落;放，霉孢子豐滿。

　　(3)保護劑的配制：配制，滅菌，檢查。

　　(4)菌懸液的制備：2-3ml保護劑。

　　(5)分裝樣品：菌懸液每管0.2ml。

　　(6)預凍：程序控溫儀降溫。

　　(7)冷凍真空干燥：-50℃下抽真空。

　　(8)取出樣品：輕敲松散即達標。

　　(9)第二次干燥。

　　(10)熔封。

　　(11)存活性檢測：抽取一管進行存活性檢查。

　　(12)保存：4℃保存。